A la fin de la saison 1, Sydney découvre que sa mère est encore vivante. Cette dernière la retient prisonnière à Taipei et est actuellement la leader d'un réseau d'espionnage secret international. Sydney reçoit une balle en pleine épaule tirée par sa mère (Irina Derevko / Laura Bristow), mais arrive tout de même à s'échapper.

L'histoire de Will est publiée et il est dans un gros pétrin. En effet il est maintenant LA cible du SD-6 qui veut l'assassiner jusqu'à ce que Jack trouve une façon de le discréditer auprès du public afin de lui sauver sa vie. Il lui injecte de l'héroïne et Will devra avouer qu'il est un drogué et qu'il a donc inventé l'article sur le SD-6 de toute pièce…

Pendant ce temps, Sydney fait un voyage en France et découvre Vaughn, vivant, dans une des cachettes de sa mère. Il est à moitié conscient et allait subir une chirurgie non prévue. Elle le secoure et ils s'échappent…

Sydney revient aux USA pour découvrir que sa mère Irina s'est rendue à la CIA, clamant qu'elle voulait coopérer. Mais Irina ne voudra parler qu'à Sydney. Leur relation sera plutôt dure au départ, mais une relation se crée au fil des épisodes et Sydney va souvent voir sa mère pour qu'elle lui donne des informations pour ces missions.

Sloane est introduit comme le 12ème chef de l'alliance des 12. Au même moment il commence à recevoir des appels téléphoniques étranges et des fleurs provenant des sa femme morte Emily. Il demande à Jack Bristow de mener une enquête discrètement.

Vaughn n'est pas vraiment ravi d'avoir des échanges avec Irina, la femme qui a tué son père, mais il le fait pour Sydney. Jack est convaincu que son ex-femme est dangereuse et qu'il ne faut pas la croire.

La C.I.A se lance dans la recherche des objets façonnés par Rambaldi dont l'organisation d'Irina essayait de retrouver la trace, tout en essayant d'avoir toujours une avance sur le SD-6. Jusqu'ici la CIA arrive à obtenir une boîte de musique contenant une équation numérique de l'énergie du zéro absolu encodé dans la musique.

Will est choisi pour aider la CIA puisqu'il sait beaucoup de chose. En effet depuis son enlèvement par M. Sark la CIA pense qu'en testant sur lui une hypnose, cela permettra d'obtenir des informations cruciales pour la CIA. Pendant ce temps Francie ouvre son restaurant.

Jack fait enfermer Irina pour l'éloigner de Sydney. Cette dernière s'en rend compte et en réfère à la CIA ce qui place Jack dans une très mauvaise position. Il s'enfoncera encore plus vis à vis de sa fille lorsqu'elle apprendra qu'il l'a placé dans un programme d'espionnage pour enfant alors qu'elle n'avait que 6 ans. Sydney commence à ne plus avoir confiance en aucun de ses parents.

Vaughn commence à enquêter sur des connections possible entre les enfants qui ont suivi le programme d'espionnage et d'anciens tests de Q.I. américains. Il propose à Will de l'aider, et ce dernier découvre que quelque chose d'étrange est apparu avec les tests QI de 1982.

L'un des cliffhanger de la saison1 revient hanter Vaughn. En effet le liquide contenu dans la boule rouge du dispositif de Muller contient un virus. Avec l'aide d'Irina, Sydney retrouve l'antidote, mais découvre au même moment que Vaughn a une amie qui l'attend à la sortie de l'hôpital.

Sark et Sloane forment une alliance imprévue pour combiner leur force dans leur chasse à Rambaldi. Dès lors Sark travaille pour le SD-6. Les 3 Bristows font un deal et partent ensemble en mission dans le Kashmir, à la recherche de missiles volés et découvrent à la palace un artefact de Rambaldi qui contiendrait des secret sur la vie éternelle.

Sloane reçoit un appel téléphonique demandant une rançon contre le retour de sa femme Emily, laquelle d'après son kidnappeur est encore en vie. Cette fois Sloane demande à l'alliance de l'aider à trouver les kidnappeur. Malheureusement le kidnappeur lui vole une grosse somme d'argent mais ne lui rend pas sa femme. Quand la CIA apprends que Sloane est en train de trouver un accès au système d'écoute " Echelon ", elle décide d'employer Irina qui arrive à bloquer le SD-6.

L'alliance envoi Ariana Kane une agent de la contre - intelligence au SD-6 pour enquêter sur le kidnapping d'Emily et divers événements incohérents survenus au SD-6. Dès son arrivée Kane s'en prend à Jack. Après quelques investigations, Kane décide aussi de suspecter Sydney, laquelle suspecte Kane de monter un coup contre le SD-6.

Après une mission réalisée avec succès à Nice, Vaughn demande à Sydney d'aller dîner en dehors du travail. Pensant qu'ils sont assez loin du SD-6, ils sont en fait surveillés par des agents d'Ariana Kane et s'en sortent de justesse. Jack en fuite est attrapé par Kane, mais il est sauvé par Sloane. En effet ce dernier a reçu des informations (de jack) sur les vraies intentions d'Ariana Kane (qui était en fait venue se venger d'un contentieux entre elle et Sloane) et l'arrête.

Sloane révèle à Jack que depuis qu'il a rejoint la direction de l'alliance, ses conversations, ces mouvements et signes vitaux sont constamment enregistrés grâce à un implant qu'on lui a placé dans le cou. Maintenant il s'est fait fabriquer un système qui lui permet de brouiller les signaux. Etant maintenant libéré de l'emprise de l'alliance, Sloane se rend secrètement aux Philippines, où il retrouve Emily finalement bien vivante ! Slaone a donc simulé la mort de sa femme, demandé une rançon à l'alliance pour en fait la garder. Avec son brouilleur il est maintenant libéré de l'alliance et va pouvoir vivre tranquillement avec sa femme.

Will célèbre son nouveau travail dans un magasin de voyage (en fait la CIA) et le succès du restaurant avec Francie. Sloane parti, le SD-6 reçoit un nouveau chef nommé Geiger, qui s'en prend assez rapidement à Jack et Sydney.

Syd entend parler d'un serveur secret qui contrôle toutes les choses de l'alliance. Après s'en être emparé, la CIA a toutes les informations nécessaire pour détruire l'alliance de 12. La CIA coordonne des raids dans les toutes les cellules (SD et autre) du monde. L'alliance est démantelée, le SD-6 mis à sac et les agents arrêtés. Depuis longtemps amoureux en " silence ", Syd et Vaughn ont enfin la possibilité de s'embrasser et de révéler leur amour au grand jour.

Après les raids de la CIA, Sark qui est toujours en fuite appelle Sloane. Il lui révèle que Sydney a bien reçu les informations qui l'ont conduit au serveur central de l'alliance (tout avait été orchestré par Sloane depuis le début de la saison !). Sark lui révèle aussi qu'un agent génétiquement modifié a tué Francie et a pris sa place ! Sydney, reçoit son diplôme de faculté et espère mettre sa carrière d'espionne au second plan. Mais elle reçoit un coup de téléphone de Sloane qui lui dit qu'il a orchestré la chute de l'alliance et qu'elle ne doit pas essayer de remonter sa piste car sinon il l'a tuera.

Après la chute du SD-6 Marshall est maintenant un agent de la CIA. Quant à Dixon, il est désillusionné et sa femme refuse qu'il devienne un espion. Il décide de lâcher l'affaire et de quitter le monde de l'espionnage. Mais alors que Sydney est kidnappé Dixon reviendra, l'a sauvera et rejoindra la CIA.

Jack persuade la CIA de laisser Irina et lui aller à la recherche d'un manuscrit de Rambaldi. Mais Irina qui avait gagné la confiance de son mari arrive à s'échapper et à rejoindre Sloane avec le manuscrit. Emily rejoint Sloane en Europe, découvre que la mère de Sydney n'est pas morte et que son mari est toujours un espion " mauvais ". Emily décide de trahir son mari en dévoilant leur cachette à la CIA, mais prise entre deux feux, elle est tuée involontairement.

En utilisant l'hypnose sur Will, la fausse Francie accède aux vidéos d'un satellite, et apprend à Sloane que c'est Dixon qui a tué Emily. Pour se venger, Sloane tuera la femme de Dixon. Sloane est désorienté suite à la mort de sa femme et décide d'aller au Tibet rendre visite à un moine qui l'avait orienté il y a longtemps sur Rambaldi. Ce que le moine lui montrera (et que l'on ne verra pas) redonnera l'envie à Sloane de terminer les plans et sa chasse des artefacts de Rambaldi.

La CIA se rend compte qu'il y a eu des fuites provenant du satellite. Or comme la fausse Francie à accédé au satellite via le poste informatique de Will ce dernier est arrêté. Lors d'un transfert, des gens essayent de tuer Will mais il arrive à s'échapper. Irina confesse à Sydney qu'elle s'est livrée à la CIA afin de découvrir la cachette de la CIA où se trouve les objets de Rambaldi. Elle lui dit aussi qu'elle a fait un pacte avec Sloane en lui promettant de lui livrer les objet de Rambaldi détenus par la CIA. Elle lui dit aussi qu'elle aime sa fille ainsi que Jack. Elle disparaît avant que Sydney lui dise qu'elle ne l'a croit pas.

Irina envoi des informations pour lever tous les soupçons sur Will, qui essaye alors de savoir qui a monté un complot sur lui. Sydney et des agents sont à Zurich pour vérifier une information d'Irina à propos d'un entrepôt sensé cacher des objets de Rambaldi appartenant à Slaone. Jack et un objet de Rambaldi en forme de cœur sont au même moment capturés par Sloane. Ce dernier dit à Jack qu'il a maintenant constitué une machine appelée " the telling " ou "Il Dire" composée de 47 artefacts de Rambaldi. L'entrepôt de Slaone se révèle être vide et Irina réalise que Sloane a du être au courant qu'elle essayait de le trahir.

A nouveau en suivant les conseils d'Irina et après avoir capturé et interrogé Sark, Sydney et des agents se rendent dans un building à Mexico où ils retrouvent Jack et le libère. Irina qui est aussi sur les lieux, s'échappe après avoir dit à Sydney que c'est d'elle dont parle la prophétie et qu'elle doit stopper Sloane. Will découvre tardivement que la fausse Francie est un double mais fini par être poignardé. Quand sydney rentre chez elle la fausse Francie l'attend. Sydney écoute alors sa messagerie pour se rendre compte que Will a découvert le pot aux roses concernant Francie. Dès lors la fausse Francie s'aperçoit qu'elle a été découverte et un violent combat démarre entre les deux femmes. Finalement Sydney arrive a tuer la fausse Francie mais tombe inconsciente ç cause de ses blessures.

Après ce combat Sydney se réveille dans une allée inconnue de Hong Kong. Elle a une cicatrice au bas du ventre. Elle appelle la CIA et se rend dans un lieu de sûreté. Vaughn arrive alors et lui donne des informations vraiment étonnantes. Sydney apprend que Will est en vie, qu'elle a disparu depuis deux ans (prétendue morte) et que Vaughn est marié puisqu'il porte une bague de mariage au doigt...